TERCER TEMA TECNICAS DE ANALISIS DEL DNA

• Huella genética (también llamada pruebas de ADN o análisis de ADN) es una técnica utilizada para distinguir entre los individuos de una misma especie utilizando muestras de su ADN. Su invención se debe el doctor Alec Jeffreys en la Universidad de Leicester en 1984¹ y fue utilizada por primera vez en medicina forense para condenar a Colin Pitchfork en los asesinatos de Narborough (UK) en 1983 y 1986.²

 La técnica se basa en que dos seres humanos tienen una gran parte de su secuencia de ADN en común y para distinguir a dos individuos se puede explotar la repetición de secuencias altamente variables llamada microsatélites. Dos seres humanos no relacionados será poco probable que tengan el mismo número de microsatélites en un determinado locus. En el SSR/STR de perfiles (que es distinto de impronta genética) la reacción en cadena de polimerasa (PCR) se utiliza para obtener suficiente ADN para luego detectar el número de repeticiones en varios Loci. Es posible establecer una selección que es muy poco probable que haya surgido por casualidad, salvo en el caso de gemelos idénticos, que tendrán idénticos perfiles genéticos pero no las huellas dactilares.

La huella genética se utiliza en la medicina forense, para identificar a los sospechosos con muestras de sangre, cabello, saliva o semen. También ha dado lugar a varias exoneraciones de condenados. Igualmente se utiliza en aplicaciones como la identificación de los restos humanos, pruebas de paternidad, la compatibilidad en la donación de órganos, el estudio de las poblaciones de animales silvestres, y el establecimiento del origen o la composición de alimentos. También se ha utilizado para generar hipótesis sobre las migraciones de los seres humanos en la prehistoria.
Los microsatélites muestran una mayor variación que el resto del genoma ya que en ellos se encuentran unas secuencias en distinta repetición y con diferente grado de recombinación debido a la inestabilidad del locus.

Técnicas de identificación de la "Huella Genética"

Análisis de RFLP

El análisis consiste en hacer un Southern Blotting (o "Southern blot" que es un método de biología molecular que sirve para verificar si una determinada secuencia de ADN está o no presente en una muestra de ADN analizada) y usar sondas específicas para detectar los VNTR (repeticiones en tandem de número variable).

En primer lugar el ADN que se va a analizar se separa de otros materiales. A continuación, debe cortarse en piezas de diferentes tamaños usando enzimas de restricción, que son proteínas que cortan el ADN sin dañar las bases. las piezas son clasificadas por tamaño mediante electroforesis en gel. Las piezas con carga positiva se van a la parte superior. El ADN que tiene una ligera carga negativa natural es atraído hacia el fondo. Las piezas más pequeñas se mueven más rápidamente a través del gel, por lo que será aún más hacia la parte inferior de las piezas grandes. Al separar las piezas por tamaño, los más altos se mantienen arriba y los más pequeños debajo. Luego por calor o solución alcalina, se aplica gel con el fin de desnaturalizar el ADN y se separa en fragmentos individuales. Una vez realizado esto el ADN esta ahora listo para ser analizados utilizando una sonda radiactiva de reacción de hibridación.

Análisis por PCR

Consiste en aplicar la técnica de PCR para amplificar regiones específicas con los cebadores adecuados. Con al invención de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) la tecnología genética tuvo un importante avance en la capacidad de recuperación de información a partir de muestras muy pequeñas. PCR consiste en la amplificación de regiones específicas de ADN usando temperatura y una enzima polimerasa termoestable junto con fluorescencia etiquetada en una secuencia específica del ADN. Existen kits comerciales que utilizan polimorfismos de núcleotido único (SNP) de discriminación disponible, estos kits de uso de PCR usados para amplificar regiones específicas con variaciones conocidas e hibridación con sondas de anclado en tarjetas, lo que resulta en una mancha de color correspondiente a una orden en particular.

Una de las principales quejas en contra del RFLP es que es lento y que requiere grandes cantidades de ADN para ser útil. Esto llevo a métodos basados en PCRque requieren menores cantidades de ADN que pueden ser también más degradados que los utilizados en análisis de RFLP.

Los ensayos de PCR son extremadamente valiosos para identificar nuevos miembros de una familia génica.

AmpFLP

Se trata de una técnica de amplificación de regiones polimórficas (con muchos polimorfismos), preferiblemente el lócus D1S80. Este análisis pueden ser automatizado, y permite la fácil creación de árboles filogenéticos basados en la comparación de las muestras individuales de ADN.

Basado en el número variable de repetición en el tandem (VTNR) para distinguir diversos polimorfismos alelos, que son separados en un gel de poliacrilamida utilizado en una escalera alelica (en oposición a un peso molecular). Bandas podrían ser visualizados por tincíon de gel de plata. Un lugar popular para la toma de huellas dactilares es el locus D1S80. Al igual que los métodos basados en PCR, el ADN degradado o en cantidades muy pequeñas de ADN puede causar alélica de abandono.

Debido a su costo relativamente bajo y la facilidad para su puesta en marcha y operación, AmpFLP sigue siendo popular en los países de bajos ingresos.

Análisis STR

Consiste en la amplificación de secuencias con pequeñas repeticiones en tandem que no se conservan dentro de la especie. Una vez amplificadas se separan los fragmentos para comprobar el número de repeticiones (mediante electroforesis capilar o en gel), de forma que se pueden distinguir patrones de repeticiones que pueden ser comparables y asociables.

Este método usa regiones altamente polimórficas que tienen secuencias cortas repetidas de ADN (el más común es de 4 bases repetidas, pero hay otras longitudes en uso, incluyendo bases 3 y 5). Porque diferentes personas tienen diferentes números de unidades de repetición y estas regiones de la DNA se puede utilizar para diferenciar entre las personas. Estos STR loci (lugares) son atacados con primers específicos de secuencia y se amplifican mediante PCR. Los fragmentos de ADN que son resultado entonces detectados y separados mediante electroforesis. Existen dos métodos de separación y detección, la electroforesis capilar (CE) y la electroforesis en gel.

Los polimorfismos STR mostrados en cada región son de por sí muy comunes, por lo general, cada polimorfismo es compartida por alrededor de un 5 - 20% de las personas. Cuando observamos múltiples loci, es la única combinación de estos polimorfismos de un individuo que hace que este método de discriminación sea un instrumento de identificación. Las regiones STR que se ponen a prueba en una persona se convierten en una discriminación de la prueba.